Esercitazioni di calorimetria (ITC). Titolazione NMR tramite esperimenti HSQC e chemical shifts mapping. Esercitazioni di spettroscopia UV/visibile e discroismo circolare: saranno caratterizzati alcuni complessi proteina-ione metallico. Esercitazione per l’utilizzo dei programmi di docking.
Non esistono testi di riferimento specifici.
Saranno forniti a lezione capitoli di libri e review article sui soggetti trattati.
Obiettivi Formativi
Conoscenze:
Il corso sarà articolato in 24 ore di lezioni frontali e circa 40 ore di esercitazioni di laboratorio (8-10 esperienze). Nella parte teorica saranno approfonditi gli aspetti sperimentali delle più importanti tecniche per lo studio di complessi biomolecolari introdotte nel corso “Interazioni biomolecolari”.
Il corso si propone di fornire allo studente le conoscenze inerenti le principali problematiche che vengono affrontate quando si vuole studiare specifiche interazioni biomolecolari. Verranno svolte delle esercitazioni volte alla produzione e purificazioni di alcune proteine ricombinanti che verranno successivamente utilizzate per le esercitazioni successive. Quest’ultime saranno volte alla caratterizzazione delle interazioni proteina-ione metallico, proteina-piccola molecola e proteina-proteina tramite alcune tecniche biofisiche e biochimiche. Inoltre verra’ spiegato che tipo di informazioni si possono ottenere da ognuna delle tecniche utilizzate per comprendere i meccanismi che regolano le interazioni biomolecolari. Saranno presentati ed utilizzati alcuni dei principali programmi di docking, con particolare riferimento ad approcci computazionali basati sull’utilizzo di informazioni sperimentali biochimiche e/o biofisiche. Saranno quindi acquisite conoscenze sui principi di base di spettroscopia elettronica, CD, calorimetria, NMR, programmi di docking.
Competenze acquisite
Conoscenza delle principali tecniche utilizzate per la caratterizzazione dell’interazione proteina-ione metallico, proteina-piccola molecola, proteina-proteina. Saper analizzare gli spettri elettronici, uno spettro CD, NMR. Saper inoltre analizzare i risultati di una misura calorimetrica.
Capacita’ acquisite al termine del corso:
Capacita’ di valutare quali sono le migliori tecniche sperimentali per lo studio di specifiche interazioni biomolecolari e capacita’ di applicare tali tecniche a determinati sistemi biologici. Saper quindi acquisire spettri elettronici, utilizzare un calorimetro, analizzare gli spettri elettronici e il dicroismo circolare (CD). Eseguire un calcolo di docking. Saper valutare in maniera critica i risultati di esperimenti di spettroscopia elettronica, CD, NMR, calorimetria. Saper interpretare in maniera critica i risultati di simulazioni in silico
Prerequisiti
Nessuno
Metodi Didattici
Numero di ore totali del corso: 24 ore di lezioni frontali + 40 esercitazioni di laboratorio (8-10 esperienze)
Numero di ore per studio personale e altre attivita’ formative di tipo individuale:
100
Numero di ore relative alle attivita’ in aula:
24
Numero di ore relative ad attivita’ di laboratorio (lezioni in laboratorio):
36
Modalità di verifica apprendimento
L'esame prevede un colloquio orale volto a verificare la padronanza
dei concetti strutturali, cinetici e termodinamici che regolano le
interazioni biomolecolari e la conoscenza delle principali
metodologie sperimentali illustrate nei due moduli in cui si
compone il corso. Sarà verificata la comprensione e la capacità di
analisi critica delle attività svolte durante le esercitazioni di
laboratorio. Durante il colloquo sarà infine accertata la capacità
dello studente di applicare le conoscenze acquisite ad alcuni
problemi pratici proposti dai docenti.
Programma del corso
La prima parte del corso affrontera' alcuni aspetti della biologia molecolare che includono le tecniche di espressione eterologa di proteine: dal DNA genomico all'isolamento della proteina: basilari procedure di estrazione e di clonaggio di geni; le tecniche di over-espressione proteica in organismi batterici e in sistemi cell-free; tecniche di purificazione di proteine; modificazioni post-traslazionali di proteine e procedure di purificazione proteica.
Il corso inoltre si propone di far conoscere agli studenti quali sono gli aspetti termodinamici e cinetici alla base delle interazioni biomolecolari tramite l’utilizzo di tecniche come la colorimetria e la spettroscopia NMR. Verra’ svolta’ una esercitazione di calorimetria (ITC) con la quale verra’ analizzato come ricavare i parametri termodinamici che caratterizzano una interazione proteina-proteina o proteina-piccola molecola. Studio dell’interazioni biomolecolari tramite NMR, sia dal lato della piccola molecola (water-Logsy, saturation transfer difference (STD)) sia da quello della proteina, (la piccola molecola si lega? dove? Quanto forte lega?) . Acquisizione ed analisi degli esperimenti NMR tipo HSQC e mappatura delle variazioni dei chemical shifts sulla struttura della proteina. Caratterizzazione dei complessi proteina-ione metallico tramite due o tre esercitazioni di spettroscopia UV/visibile e discroismo circolare. Esercitazione per l’utilizzo dei programmi di docking.