Sistemi cellulari: lieviti, cellule di insetto, linee cellulari di mammifero, cellule staminali, cellule tumorali. Mantenimento di colture in vitro. Mantenimento e differenziamento di cellule staminali. Espressione di proteine in lievito, in cellule di insetto, in cellule di mammifero. Selezione di linee cellulari stabili. Manipolazione genetica. Esercitazioni in laboratorio.
Materiale didattico fornito dal docente e presente sulla piattaforma elearning
dell’università (accesso degli studenti iscritti al corso mediante
le proprie credenziali)
Obiettivi Formativi
L'obiettivo è quello di trasmettere un'informazione aggiornata sui metodi di coltura e di manipolazione di lieviti, cellule di insetto, linee cellulari di mammifero, cellule staminali e cellule tumorali, al fine di apprendere i loro principali ambiti biotecnologici di applicazione
Prerequisiti
E’ richiesta una buona conoscenza degli argomenti di biologia generale e biologia molecolare
Metodi Didattici
Lezioni frontali ed esercitazioni in laboratorio
Modalità di verifica apprendimento
Esame Orale
Programma del corso
Lezioni frontali:
Introduzione ai diversi sistemi cellulari: lieviti, cellule di insetto, linee cellulari umane, cellule staminali, cellule tumorali. Mantenimento di colture in vitro, in sospensione e in adesione. Cellule staminali: mantenimento, supporti, co-colture, fattori di crescita, meccanismi molecolari di differenziamento, cellule staminali embrionali (ESC), somatiche (ASC), cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC). Colture su supporti tridimensionali, sferoidi, organoidi e loro applicazioni. Lievito: condizioni di crescita e mantenimento, manipolazione genetica, espressione di proteine ricombinanti, sistemi di induzione. Cellule di insetto: caratteristiche e crescita di colture, manipolazione genetica tramite infezione di baculovirus, espressione di proteine. Linee cellulari di mammifero: crescita e mantenimento, tecniche di trasfezione. Metodi di espressione in cellule di mammifero: promotori costitutivi e inducibili, Tet-On/Tet-Off, espressione di proteine ricombinanti, secrezione, modificazioni post-traduzionali. Metodi per la selezione di linee cellulari stabili, marker di selezione, reporter fluorescenti. Manipolazione genetica mediante uso di trasposoni. Tecniche di genome editing: zinc finger nucleases (ZFNs), transcription activator-like effector nucleases (TALENs), sistema CRISPR/Cas9.
Laboratori:
Lavorare con le cellule in adesione. Distacco delle cellule con tripsina. Conta delle cellule in camera di Burker. Metodi di Valutazione della vitalità cellulare. Semina delle cellule per la determinazione del valore di IC50 di un agente citotossico mediante saggio con bromuro di 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolio (MMT). Calcolo dell'IC50 mediante l'utilizzo del programma GraphPad.
Valutazione del metabolismo cellulare: dosaggio del lattato nel sovranatante di colture cellulari. Misura del consumo di ossigeno in cellule intere. Ossigrafia con elettrodo di Clark. Valutazione della funzione mitocondriale con strumentazione Seahorse (parte teorica, visione di video, visita dello strumento)
Preparazione di un lisato proteico partendo da cellule in adesione su piastra. Dosaggio di proteine con il metodo Bradford. Costruzione della curva di taratura e determinazione della concentrazione proteica con il programma Excel.
Valutazione della migrazione cellulare. Saggio di riparazione della ferita. Migrazione in camera di Boyden. Utilizzo del programma ImageJ per l’analisi dei dati.
Laboratorio virtuale. Progettazione del clonaggio e dell'espressione di una proteina in sistemi cellulari eucariotici. Presentazione degli studenti